细胞侵袭实验方法

将细胞小室 (Transwell 小室) 放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响^[1]。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

1. 将 Matrigel 溶液 4℃ 解冻过夜。

2. 在 Transwell 膜的下表面涂上 25 µL 的 Matrigel 溶液。

3. Transwell 与 Matrigel 在 37℃ 孵育 30 分钟成胶。

4. 在 24 孔板的每孔中加入 500 µL 培养基 (含或不含化学引诱剂) (例如，对于黑色素瘤细胞 transwell 实验，使用 10% 胎牛血清作为化学引诱剂)。

5. 使用无菌镊子将 transwell 插入物转移到已经充满培养基 (带或不带化学引诱剂) 的 24 孔板的每孔中。

6. 将 400 µL 细胞悬液 (最终汇合 50-60%) 添加到 transwell 上腔。

7. 37℃和 5% CO₂ 孵育 20-24 小时。

8. 将培养基中终浓度为 4% 的多聚甲醛 (PFA) 加入每个 transwell 插入物的两侧，在室温下固定细胞 15 分钟。

9. 轻轻吸出含有 4% PFA 的培养基。

10. 用无菌的 1X PBS 在膜的两侧清洗 transwell 插入物两次，去除碎片、未附着的细胞和多余的固定液。

11. 将 transwell 插入物 (含或不含 Matrigel) 与 Hoechst 在 RT 下避光孵育 15 分钟，对细胞进行染色 (也可使用结晶紫或苏木精)。

12. 用无菌 1X PBS 清洗 transwell 插入物两次，去除过量的 Hoechst 溶液。

13. 成像:使用荧光显微镜覆盖整个表面，捕捉一些 Transwell 插入膜的图像。

14. 数据分析:使用 ImageJ 等开源软件打开并分析获取的图像。

1. 基质胶在室温下容易凝固，铺胶过程全程需要在冰上操作。

2. 基质胶浓度也是影响细胞迁移和侵袭的因素之一，所以基质胶的浓度和稀释比例需根据供应商提供的信息和实验具体情况调整，必要时可设置预实验摸索最佳浓度和稀释比例。

3. 铺胶时，尽量垂直小室底部在小室底部中间加入，可避免气泡的产生。

4. 吸出小室内未结合的基质胶时需确保移液管的尖端不会刮伤凝胶层表面。

5. 不同细胞的迁移和侵袭能力不同，可设置一系列细胞密度梯度摸索合适的细胞接种密度。

6. 小室的放置过程经常有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失，因此需特别留心。一旦出现气泡，需将小室提起或用枪头去除，去除气泡后重新放置。

7. 接种细胞 1-2 小时后，可对培养板进行检查，确保没有大气泡产生。但有时会观察到有极小的气包产生，但并不影响细胞迁移和侵袭，也可轻轻敲击孔板去除。

8. 用 PBS 清洗小室时，需避物理触碰小室底部。可以准备几个无菌烧杯或培养皿，倒入适量 PBS，依次涮洗，可提高效率。

9. 拍照前需适当晾干小室，水分会影响镜下视野。