细胞复苏实验方法

细胞复苏是通过快速融化的手段保证细胞外结晶在很短时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞重新结晶对细胞造成损害，复苏成功的细胞可以保持很高的活力^[1][2][3][4]。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

1. 实验前备冰盒，快速由液氮中取出冻存的细胞，置于冰盒内。

2. 迅速将冻存管投入到已经预热到 37℃ 的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。

3. 迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒，然后放置在冰浴上。

4. 从 37℃ 水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加 10 倍以上新鲜培养液，混匀；离心，1000 rpm，5 min。

5. 弃上清，加入 10 倍以上新鲜培养液，混匀；离心，1000 rpm，5 min。

6. 弃去上清液，加入含 10% 胎牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养皿，37℃ 培养箱静置培养。

7. 次日更换一次培养液，继续培养。

1. 细胞复苏的整个过程注意无菌操作。

2. 将细胞从液氮罐中取出时要带手套或用镊子，以防冻伤。

3. 细胞复苏过程中，升温的速率要大，把从液氮或 -70℃ 冰箱中取出的细胞在最短的时间内放入水浴锅。

4. 解冻过程最好在 1 分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约 1 min后冻存管内液体完全溶解。37℃ 水浴时间延长会提高细胞死亡率，复苏过程中一般细胞死亡率在 20%～25% 之间。

5. 细胞解冻时，一次复苏细胞不宜过多，水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。并且一次复苏细胞过多，容易忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

6. 冻存液对细胞有毒性，解冻后必须用 PBS 或培养基洗两遍才能移入培养瓶中培养。

7. 取细胞的过程中未带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸，当然，选择好的冻存管此状况一般不会发生。