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关于抗性筛选-不得不了解的那些事儿

 

 

“任你孵育浓度多大,我依旧顽强生长”,从抗生素的“捕杀”中逃脱,并展示出自己优越的基因优势,是我们期待的细胞抗生素筛选结果。那什么是抗性筛选呢。近期,小 M 收到很多客户对于细胞抗生素筛选的咨询,所以聪明伶俐的小 M 现身啦。
 

 

 
关于抗生素
 
 
抗生素是一组用于抑制微生物生长或者杀死微生物的药物,一般用来抑制感染,例如我们生活中十分熟悉的青霉素、红霉素、头孢菌素等等就是典型的抗生素。抗生素的发现大大改善了炎症和感染,但是由于细菌变得越来越聪明,问题也随之而来,那就是抗生素的耐药性。

 

 1. 抗生素按照作用机制分类[1]

 

 
转染与抗生素筛选
 
 
 
 
转染  (Transfection)   是真核细胞主动或被动导入外源核酸片段而获得新表型的过程,引入的遗传物质 (DNA 和 RNA) 稳定或暂时存在于细胞中,据此,转染可分为稳定转染和瞬时转染。
 
 
稳定转染: 引入的遗传物质常带选择性标记基因,它们被整合到宿主的基因组中,即使在宿主细胞分裂传代后也能维持转基因的表达。即稳转的细胞系通过一些选择性标记反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。

瞬时转染:引入的遗传物质仅在有限的时间内表达,并且不会整合到基因组中。遗传物质也会因环境因素和细胞分裂而丢失,瞬时转染维持时间较短,需尽快在蛋白或基因水平进行相应的检测。
 

图 2. 两种不同的转染方式[4]
A. 稳定转染; B. 瞬时转染

 

 
关于抗生素抗性筛选: 携带抗生素抗性标记的载体进入细胞,转染成功的细胞在含有抗生素的选择培养基中生长,而不带有抗性基因的细胞会被抗生素杀死,最后获得稳定的带抗性细胞株。因此,抗生素抗性标记是区分稳定转染和瞬时转染的有效方法。
  

在原核/真核生物转染实验中常用的抗生素有很多,例如嘌呤霉素G418卡那霉素四环素博来霉素等等,这里小 M 以其中几个为例,给大家详解一波~

 
嘌呤霉素 (Puromycin)

嘌呤霉素是一种氨基核苷类抗生素,是真核和原核生物中蛋白质翻译的有效抑制剂。如图 3 所示,嘌呤霉素通过模拟氨酰化 tRNA (aa-tRNA) 的 3' 末端,代替正常氨基酸参与翻译延长过程。它通过核糖体肽基转移酶中心 (PTC) 催化掺入新生链的 C 末端,阻止进一步延伸,导致翻译过早的终止,从而抑制了蛋白质合成。

 

图 3. 嘌呤霉素的作用机制[6]

 

编码嘌呤霉素抗性的基因——嘌呤霉素 N-乙酰转移酶 (PAC) 的 pac 基因,是从 Streptomyces alboniger 中分离出来的,早在 1988 年,PAC 就首次被用作分离稳定转染的哺乳动物细胞系的显性选择标记。

 

Mikołaj Słabicki 等在 Nature 上发表的 Small-molecule-induced polymerization triggers degradation of BCL6 中使用嘌呤霉素筛选抗性的 HEK293TCas9 细胞。首先将 HEK293TCas9 细胞进行慢病毒转染,然后再用嘌呤霉素孵育进行筛选。因低浓度的嘌呤霉素对活细胞具有毒性,所以筛选后存活下来的细胞即具有嘌呤霉素抗性。Yunhao Chen 等在 Mol Cancer 上发表的 WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1 中,也是选取了 4 个细胞系,在用慢病毒转染后,用嘌呤霉素感染细胞 1 周或更长时间,通过 RT-qPCR 和 WB 分析确定转染的效率。

 

图 4. 嘌呤霉素抗性细胞筛选过程

 
G418
G418,一种氨基糖苷类抗生素,由细菌 Micro-monospora rhodorangea 产生,其结构与 新霉素 庆大霉素 和卡那霉素类似。G418 的抗性是由来自 Tn5 的编码氨基糖苷 3'-磷酸转移酶 APH 3' II 的新霉素抗性基因 (neo) 介导的。与只对原核生物有作用的新霉素不同,G418 对细菌、酵母、原生动物、蠕虫和哺乳动物细胞均具有广泛的毒性。G418 与细胞中的 70S 或者 80S 核糖体进行不可逆的结合,抑制蛋白质延伸,进而阻断了多肽的合成。
 

 

图 5. G418 抗性细胞筛选过程[14]

注:  只有经转座子 Tn5 或 Tn601 的 neo  基因转染的细胞可获得对 G418 的抗性; G418 的有效浓度因细胞的生长培养基、培养条件和代谢率而异。
 
卡那霉素 (Bekanamycin)
卡那霉素一种广谱氨基糖苷类抗生素,可以从细菌 Streptomyces kanamyceticus 中分离出来。卡那霉素与 30S 核糖体亚基中的 16S rRNA 受体不可逆结合后,会影响 mRNA 密码子向氨基酸的翻译,引起 mRNA 的误读或易位抑制,从而抑制蛋白质合成(图 6B)。
 

图 6. 卡那霉素的作用机制 [17]
A: 核糖体中的正常翻译过程; B: 卡那霉素 (K) 影响翻译过程

 

四环素 (Tetracycline)

四环素,是一种广谱的抗生素,对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、非典型生物如衣原体、支原体和立克次体以及原生动物寄生虫具有活性。如图 7,四环素与细菌核糖体的 30S 亚基可逆结合,抑制氨酰-tRNA 与 mRNA-核糖体复合物的结合,即防止任何进入的氨酰基-tRNA 被信使 RNA 中的密码子识别,从而抑制蛋白质的合成。

 

对四环素的抗性是通过以下几种机制之一介导的:四环素流出、通过将特定细胞质蛋白与核糖体结合来保护四环素结合位点、四环素修饰或在四环素结合位点处对 16S rRNA 进行修饰。

 

图 7. 四环素在核糖体位点结合并阻断 tRNA 结合[20]

 

小结:
小 M 今天给大家介绍了细胞抗生素筛选标记的原理,并以嘌呤霉素、G418、卡那霉素、四环素为例,详细说明了抑制蛋白质生物合成类抗生素的作用机制。

关于稳定筛选,无论是真核筛选还是原核筛选,实验理论较为简单,但实际操作不简单~但看完本文,有没有 get 到新思路 ? 

 

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参考文献

 

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