铁死亡是什么，怎么检测？您要的“一文通”来了！

铁死亡 (Ferroptosis)，是一种新型的调节性细胞死亡形式，自被发现就引起了研究狂潮，热度不减。近年来铁死亡相关论文也一直在勇攀高峰，今天，小编就带大家简单了解一下铁死亡是怎么回事~

多细胞生物中，调节性细胞死亡过程 (RCD) 是细胞维持组织形态和功能必不可少的稳态机制。此前研究较多的调节性细胞死亡包括三大类：细胞凋亡、自噬和坏死。

“铁死亡”这一概念最早在 2012 年由 Dr. Brent R Stockwell 提出，它是一种铁离子依赖的新型细胞调节性死亡，在细胞形态学上，生化特征区别于细胞凋亡、坏死、自噬。从机制上简单来说，铁死亡是细胞膜上铁依赖性的高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，诱导的细胞死亡。

近来年，铁死亡相关研究是如火如荼，前途一片光明。今年 1 月，广州医科大学唐道林教授团队在 Nat Rev Clin Oncol 上发表题为 Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer 的综述。Emmm，看标题就气势如虹。接下来，和小 M 一起来“开开眼界”吧。

图 1. 铁死亡在癌症中的作用^[1]

■ 外源性途径或转运体依赖途径

1、抑制胱氨酸/谷氨酸转运受体 (System xc^-) 来促进铁死亡

■ 内源性途径或酶调控途径

内源性途径是通过阻断细胞内抗氧化酶 (如谷胱甘肽过氧化物酶 GPX4) 激活的。

1、抑制 GPX4 诱导铁死亡

脂质过氧化物积累是铁死亡的标志。GPX4 可将细胞毒性脂质过氧化物 (L-OOH) 还原为相应的醇 (L-OH)，抑制 GPX4 活性会导致细胞膜脂质过氧化物的积累。 

直接抑制：如 RSL3 作为铁死亡诱导剂，可直接作用于 GPX4 并抑制其活性，因此降低了细胞的抗氧化能力并积累了 ROS，从而导致铁死亡。

2、其他酶的调节途径与脂肪酸积累

乙酰辅酶 A 羧化酶 (ACAC) 介导的脂肪酸合成，脂质吞噬 (Lipophagy) 介导的脂肪酸释放，可诱导细胞内游离脂肪酸的积累，促进铁死亡。

长链脂肪酸 CoA 连接酶 4 (ACSL4) 和溶血磷脂酰基转移酶 3 (LPCAT3) 促进多不饱和脂肪酸 (PUFA) 掺入磷脂中形成多不饱和脂肪酸的磷脂 (PUFA-PL)。PUFA-PLs 易受脂氧合酶 (ALOXs) 介导的自由基引发的氧化作用。这种氧化作用最终会导致脂质双层破坏并影响膜功能，从而促进铁死亡。

上文介绍了铁死亡的基本途径。铁死亡有哪些研究策略呢？下面以文献 Energy-stress-mediated AMPK activation inhibits ferroptosis 为例。

作者团队建立了特定病理过程 (铁死亡) 的细胞模型，使用多种诱导剂和抑制剂，以及多种检测方法证明铁死亡与 AMPK 的调控关系，并建立了 AMPKα1/α2 的基因敲除细胞系 (AMPK DKO)，验证 AMPK 缺失对铁死亡敏感性的机制。

■ 确立铁死亡病理模型

1、能量应激 (Energy stress) 抑制铁死亡

首先，研究人员探索了永生化小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) 中，葡萄糖饥饿条件对 Erastin 诱导的铁死亡的影响。首先，证明 Erastin 诱导铁死亡：Caspase-3 或 PARP 裂解均未下调 (细胞凋亡的标志)，而且铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 可以逆转 Erastin 诱导的细胞死亡。最初他们预想，葡萄糖饥饿的条件下会增强  Erastin 诱导的铁死亡，结果恰恰相反：葡萄糖饥饿很大程度上逆转了 MEFs 中引起的铁死亡。

作者团队进一步选择了其他可诱导或模拟能量应激的化合物，包括 2-脱氧葡萄糖 (2-DG)、阿卡地新 (AICAR)、A769662。这些化合物也显著抑制了由 Erastin 处理引起的脂质过氧化和铁死亡。综上所述，能量应激抑制了铁死亡。

2、AMPKα1/α2 的基因敲除细胞系建立

3、AMPK 失活使癌细胞对铁死亡敏感

AMPK 在高基础 AMPK 磷酸化水平的癌细胞系中是否会促进铁死亡抗性？AMPK 抑制剂 Compound C 可下调 AMPK 的激活，如图 5a-b，Compound C 处理使 ACHN 细胞 (高基础 AMPK 磷酸化的抗铁碱化细胞系) 对 Erastin 或胱氨酸耗竭变敏感。透射电子显微镜 (TEM) 的结果也显示，ACHN 细胞中，Compound C 与 Erastin 或胱氨酸耗竭共同处理导致线粒体收缩，膜密度增加，细胞核中没有明显的 DNA 片段化 (铁死亡的细胞特征形态特征)。这表明 AMPK 的抑制使癌细胞对铁死亡敏感。

图 5. Erastin 或胱氨酸耗竭条件下 ACHN 细胞对铁死亡的敏感性

总结：

1、GSH-GPX4 抗氧化系统在铁死亡途径中起重要作用。脂质过氧化物增加，转铁蛋白等介导的铁的积累，以及细胞内游离脂肪酸的积累都可以诱导铁死亡。

2、Hyemin Lee 等人使用铁死亡通路相关的抑制剂/诱导剂，以及建立了 AMPK 敲除细胞系，证明铁死亡与 AMPK 之间的调节关系。

3、常见的检测铁死亡的实验方法：铁死亡相关细胞存活分析，如文中的 CCK8 法 (其他细胞活力检测方法还包括 MTT 法，台盼蓝染色等)。

4、除了细胞活力测定，脂质氧化水平的测定 (文献中的 C11-BODIPY 染色)，GSH 测定，线粒体 ROS 测定，以及 GPX4 活性测定，电镜下线粒体的变化的监测，特异性靶标分子的分析 (WB、IHC、IF) 也是常用的检测手段。

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