自噬

自噬 (autophagy) 意为自体吞噬，是真核细胞在自噬相关基因 (autophagy related gene，Atg) 的调控下利用溶酶体降解自身细胞质蛋白和受损细胞器的过程。在生理条件下，细胞自噬水平通常较低。但在饥饿、缺氧和疾病等刺激下自噬活性会显著上调^[1]。

细胞自噬在不同阶段包括自噬初期、自噬中期和自噬后期分别具有不同的形态学特征。微管相关蛋白轻链3 (microtubule-associated proteins light chain 3, MAP1LC3)，简称 LC3 (light chain 3) 贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记物。自噬过程中，胞浆型 LC3 (LC3-I) 被酶解掉一小段多肽，转变为膜型 (LC3-II)，通过 Western Blot 和荧光显微镜可检测 LC3-II/I 比值的大小变化进而分析自噬水平的高低^[1]。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

以 Hela 细胞的 LC3 荧光染色为例

1. 饥饿处理细胞后，移除培养基，加入 PBS 快速洗涤细胞一次。

2. 轻柔快速向细胞中加入 2 mL 预冷的甲醇，-20℃ 固定 10 分钟。

3. 移除甲醇，轻柔加入 PBS 洗涤 3 次 (细胞可暂存于 4℃ PBS 中)。

4. 封闭缓冲液封闭细胞 1.5 小时。

5. 加入 LC3 抗体 4℃ 过夜孵育。

6. PBS 洗涤 5 分钟 (三次)。

7. 加入对应荧光二抗室温孵育 1 小时。

8. PBS 洗涤 5 分钟 (三次)。

9. 加入 Hoechst 孵育 10 分钟。

10. PBS 洗涤 5 分钟 (三次) (可暂存于 PBS 中或尽快拍摄荧光)。

1. 样本的固定

处理之后应及时固定细胞，避免因固定不及时导致蛋白降解。

2. 结果的观察

染色之后应及时观察，避免荧光发生淬灭；

若对细胞爬片进行染色可以在最后一步使用含有抗淬灭剂的封片剂。