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干货分享 | 3T3-L1 成脂诱导在手，代谢实验不愁！

 

 

 

小白：师姐，我要做 3T3-L1 成脂诱导分化，但是这个成脂诱导培养基好贵呀。如果我买组分自己配置的话，这么多组分，怎么配置呢？图片

师姐：图片 嘘~你问师姐我就对了！MCE 家有一整套的试剂，还能保证溶解出来 DMSO 的体积不超标，并且已经有其他学者使用它们的产品发表过文献了喔。

 

 

肥胖的特征是脂肪组织的质量或功能随着能量获取和消耗的失衡而增加，它与糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝和某些癌症等代谢性疾病密切相关[1]。脂肪库的扩张 (尤其是白色脂肪组织) 以脂肪细胞体积增加 (肥大) 或由前体细胞形成新脂肪细胞 (增生) 为特征[2]。因此诱导细胞成脂在肥胖相关疾病的机制研究和药物开发中发挥重要的作用。

 

 

01
成脂诱导: 3T3-L1
ADIPOGENIC INDUCTION
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3T3-L1 是从小鼠胚胎中分离出来的成纤维细胞，由于其具有从成纤维细胞分化为脂肪细胞的潜力，被广泛用于研究脂肪生成和脂肪细胞的生物化学[3][4]。

 

画板 12-100.jpg

图 1. 3T3-L1 的细胞形态。

图片来源: https://nnw.atec.org/products/cl-173

 

将 3T3-L1 细胞从成纤维细胞表型转化为脂肪细胞，最早使用“鸡尾酒法”诱导 3T3-L1 细胞成脂分化，即在生长停止后用促分化剂处理它们。最常用的药物是胰岛素 (Insulin)，地塞米松 (Dexamethasone)  和 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (IBMX)，浓度通常分别为 1 ug/mL，0.25 uM 和 0.5 mM[5][6][7]。在加入这些试剂大约 4 天后，细胞应该开始以脂滴的形式积累脂质，随着培养时间的推移，脂滴的数量和大小都会增加。但这种方法分化效率低，并且随着传代次数的增加而迅速下降。为了解决这一问题，Katja Zebisch 等发现在这种方法的基础上加入曲格列酮 (Troglitazone，PPARγ 激动剂) 可以大大提高诱导效率，现在也成为诱导 3T3-L1 成脂分化的经典方法[9]。

 

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图 2. 罗格列酮对 3T3-l1 细胞分化的影响[9]。

显微镜图片:3T3-L1 前脂肪细胞（对照）和 3T3-L1 细胞在第 6 代和第 10 代中使用罗格列酮 (Rosiglitazone) 或不使用罗格列酮的方法进行脂肪细胞分化 14 天的细胞培养皿。用数码相机拍摄染色细胞培养皿。3T3-L1 细胞单胞体用 25 倍的反相显微镜拍摄。(B) 在含或不含罗格列酮的分化培养基中 3T3-L1 分化流程图。

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02
成脂诱导液的配置
PREPARATION OF INDUCTION FLUID
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1. 母液配置

按照表 1 中的配方配置成脂分化培养基母液。

  • MCE 提供水溶性的地塞米松 (HY-14648C) 在水中的溶解度：≥ 100 mg/mL，可供不同方案的诱导实验的需求。

  • MCE 提供溶液包装的胰岛素 (HY-P0035A)，不需要调节 pH，可以直接加到细胞中进行培养。

表 1. 成脂诱导培养基母液配方。

画板 14-100.jpg

 

 
2. 工作液配置

以 50 mL 培养基为例，进行工作液配置。

（1）成脂诱导分化培养基 A 液成分：

  • 分别取 50 μL 1 mM DXM、50 μL 500 mM IBMX、50 μL 2 mM Rosiglitazone 和 50 μL 10 mg/mL 胰岛素母液加入 50 mL 含有 10 % FBS 和 1% P/S 的 DMEM 高糖培养基中即可。

（2）成脂诱导分化培养基 B 液成分：

  • 取 50 μL 的 10 mg/mL 胰岛素母液，加入含有 10 % FBS 和 1% P/S 的 DMEM 高糖培养基中即可。

 

 

03
成脂诱导培养
INDUCTION CULTURE
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取对数生长期的 3T3-L1 细胞，按照适宜细胞密度接种培养器皿中，于 37℃，5% CO2 培养环境下培养至汇合度 70-80%。

 
1. 诱导方案 (一)

细胞培养基弃掉上清，加入成脂诱导分化培养基 A 液，诱导 2 天后，吸去培养板中的 A 液，加入成脂诱导分化培养基 B 液，成脂诱导分化培养基 B 液维持 2 天后，吸去 B液，换回 A 液进行诱导。A 液和 B 液交替使用，期间需每天观察细胞状态。重复诱导和维持过程，直到出现足量、大小适宜的脂滴，即可准备染色。

 
2. 诱导方案 (二)

细胞培养基弃掉上清，加入成脂诱导分化培养基 A 液。成脂诱导分化培养基 A 诱导 2 天后，吸去培养板中的 A 液，加入成脂诱导分化培养基 B 液，成脂诱导分化培养基 B 液维持 4 天后，期间每两天换液一次，直到出现足量、大小适宜的脂滴，即可准备染色[10]。

 

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图 3. MCE 客户使用此方法进行成脂诱导效果图[10]。

A. 3T3-L1 诱导组；B. 高渗性诱导 3T3-L1 脂肪细胞去分化 (使用到的MCE的产品：HY-P0035，HY-14648 和 HY-12318)。

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04
成脂诱导分析
INDUCTION ANALYSIS
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1. 定性分析

3T3-L1 细胞内脂滴 (lipid droplet, LD) 染色方法主要有油红 O 染色 (Oil Red O)、尼罗红染色 (Nile Red)、BODIPY 脂滴类染料等。(小 M 之前已经单独介绍过相关的资料啦，有需要可以点击这里)

 
2. 半定量分析

将 0.35 g Oil Red O 溶解在 100 mL 纯异丙醇中。3T3-L1 细胞在室温下用 3.7% 甲醛固定 1 h，然后进行两次清洗，然后用吹风机完全吹干。固定后的细胞用 Oil Red O 染色，用蒸馏水（6:4）在室温下稀释 1 h，再用蒸馏水洗涤 4 次。加入 100-200 uL 的异丙醇抽提 Oil Red O，测定 OD 490 nm 吸光度[11][12]。

 

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图 4. 3T3-L1 诱导染色和半定量结果[12]。

3T3-L1 细胞过表达结合 RFP 的 Stomatin (hSTOM-RFP)，以 RFP 作为对照，诱导分化。对所得脂肪细胞样细胞的脂质含量进行染色和半定量。

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05
脂滴大小的测量
MEASUREMENT OF LIPID DROPLET
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两个小 LD 融合可形成大 LD,较大的 LD 可能是由于脂质含量逐渐被较小的 LD 囊泡“填充”到这样的 LD 中而产生的,因此测量单个 LD 的大小对于研究 LD 融合十分必要。染色后的成脂效果图可以拍照之后用图像分析软件 (例如 Imagescope) 分析脂肪细胞的大小和单个脂肪细胞的面积[12]。

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图 5. STOM 敲低细胞中小 LD 较多，大 LD 较少[12]。

用 Bodipy-FL 染色 3T3-L1 细胞，并在差干涉对比 (DIC) 和荧光 (Flu) 显微镜下观察,然后利用 Imagescope 软件测定脂滴大小。

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3. 诱导注意事项

Tips 1. 细胞添加诱导剂时，手法要轻，尽量用枪头贴壁缓慢加入，这样对细胞的冲击最小，否则容易造成细胞卷边飘起。也可在接种前加用 0.1% 明胶对培养板进行包被。

Tips 2. 细胞代数直接决定诱导效果。代数越多，成脂能力越弱，需要诱导的时间也就越长，可适当增加地塞米松和胰岛素用量；

Tips 3. 从添加诱导剂开始到分化结束，通常需要两轮诱导。一般第 6 天脂滴就出来了，剩下 2 天就是脂滴积聚的过程。分化效果好的话，第 4 天脂滴就能出来。

Tips 4. 实验中所使用的工作液尽量现用现配。

 

 

产品推荐

Dexamethasone (HY-14648)

糖皮质激素受体激动剂。

IBMX (HY-12318)

广谱的磷酸二酯酶抑制剂。

Rosiglitazone (HY-17386)

口服活性的 PPARγ 选择性激动剂。

Insulin (human) (HY-P0035)

胰岛素，可以调节葡萄糖水平。

Fetal Bovine Serum (HY-T1000)

来源于非疫区健康牛 (不含 BVDV、PI3、IBR、BTV 等牛源病毒)，由剖腹产 5-8 月龄胎牛的血液制备而成。

Penicillin-Streptomycin (100×), Sterile (HY-K1006)

双抗，已过滤除菌，可直接用于细胞培养。

DMEM (High Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES) (HY-K3001)

适于培养多种哺乳动物细胞，以及原代成纤维细胞、神经元、神经胶质细胞、人脐带静脉内皮细胞、平滑肌细胞等。

BODIPY-FL (HY-43520)

用于探究小鼠胚胎干细胞中的鞘脂内化、运输和内吞作用。

 

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 [1] Schwartz MW, et al. Obesity Pathogenesis: An Endocrine Society Scientific Statement. Endocr Rev. 2017;38(4):267-296.

[2] Jo J, et al. Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth. PLoS Comput Biol. 2009;5(3):e1000324.

[3] Howard Green, et al. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1974 March:Volume 1, Issue 3p 113-116.

[4] Poulos SP, et al. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood). 2010;235(10):1185-1193.

[5] Green H, et al. An established pre-adipose cell line and its differentiation in culture. Cell. 1974 Oct;3(2):127-33. 

[6] Rubin CS, et al. Development of hormone receptors and hormonal responsiveness in vitro. Insulin receptors and insulin sensitivity in the preadipocyte and adipocyte forms of 3T3-L1 cells. J Biol Chem. 1978 Oct 25;253(20):7570-8. 

[7] Russell TR, et al. Conversion of 3T3 fibroblasts into adipose cells: triggering of differentiation by prostaglandin F2alpha and 1-methyl-3-isobutyl xanthine. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976 Dec;73(12):4516-20. 

[8] Poulos SP, et al. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood). 2010 Oct;235(10):1185-93.

[9] Zebisch K, Voigt V, Wabitsch M, Brandsch M. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes. Anal Biochem. 2012;425(1):88-90.  

[10] Liu G, et al. Hypertonicity induces mitochondrial extracellular vesicles (MEVs) that activate TNF-α and β-catenin signaling to promote adipocyte dedifferentiation. Stem Cell Res Ther. 2023;14(1):333.

[11] Green H, et al. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 1975;5(1):19-27. 

[12] Wu SC, et al. Stomatin modulates adipogenesis through the ERK pathway and regulates fatty acid uptake and lipid droplet growth. Nat Commun. 2022;13(1):4174. 

 

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