1. 资源中心
  2. 科学进展
  3. CY 染料档案,想要了解的看这里!

CY 染料档案,想要了解的看这里!

 

 

CY 染料由于其特异性高、毒性小等优点,在荧光染料界素有染料“交际花”的美誉,是抗体、蛋白标记中的常客。但是有些同学们在使用 CY 染料时会出现一些操作问题,今天小 M 带大家扒一扒 CY 染料的“老底”。
 

 

CY 为花菁 (Cyanine) 的缩写,经典的菁染料含有两个含氮杂环,分子内部含有由甲川基 (CH)n 组成的共轭链,n 可为奇数或偶数。吸光度和荧光波长可通过选择聚次甲基桥的长度来控制:越长的花菁素具有较高的吸光度和发射波长 (图 1 所示)。根据链中的碳原子数,菁类由甲川基被分为一甲基 (CY1,n=0)、三甲基 (CY3,n=1)、五甲基 (CY5,n=2) 和七甲基 (CY7,n=3)。

 

 

图 1. 经典花菁素结构及发射光谱示意图

 

 
CY 染料的分类
 
 
CY 染料分为非磺化花菁和磺化花菁 。两者的光谱特性基本相同,在 DNA 和蛋白质的标记中,它们是可互换的,两种均可用于标记生物分子。磺化花菁染料具体水溶性,且不易在水中聚集,是抗体和蛋白标记的首选。

 

图 2. 共聚焦显微镜观察患者肾、肝和肿瘤的组织切片中 Cy5 的摄取情况[3]

文中所用 Cy5 来自 MCE

 
 
CY 活化基团的选择
 
 
根据需要标记的生物分子的可标记基团 (胺基、醛基或巯基) 以及酸碱性,选择相应的活化染料和反应条件。为减少空间位阻影响,CY 染料常做各种修饰,具体如下:
 
1) Succinimidyl ester (SE) 修饰:
该类型 CY 染料可与蛋白的氨基末端或伯胺反应,从而实现包括多肽、抗体等的蛋白标记。标记反应相对于游离酸形式,空间位阻更小,反应更加稳定,高效
 
如 Shiqi Huang 等人研制出一种经过修饰的纳米载体,用于治疗因黑色素瘤导致的肺部肿瘤,研究人员用 Cy5-SE 标记了四种修饰的纳米颗粒导入小鼠体内,并观察肺部荧光图像,进而确定纳米颗粒的聚集情况。结果表明,小鼠的肺部有大量的  Cy5-SE 标记的纳米颗粒靶向聚集,延缓了肿瘤的生长,该文章用荧光标记的方法证明了纳米载体抗肿瘤活性实验的可靠性

 图3. CY5-SE 标记四种修饰载体蛋白的荧光图像[2]

 

2) Hydrazide (酰肼) 修饰:
该类型 CY 染料可与蛋白等生物分子的醛基反应,多用于神经元细胞的电极失踪和神经缝隙连接硏究;
该类型 CY 染料还可用于糖基化抗体的标记;如 J.E.Noble 等用 Hydrazide 修饰的 CY3对四种糖基化抗体进行偶联 (半乳糖、唾液酸、N 乙酰氨基葡萄糖和甘露糖),得到稳定的 CY3-Hydrazide 标记抗体。
3) Maleimide (马米酰亚胺) 修饰:
该类型 CY 染料可与蛋白等生物分子的巯基反应,实现高效标记。
 
 
CY 花菁类染料优点
 
 

1) 光谱窄,信号强;

2) 花菁类染料的摩尔吸光系数高于其他荧光染料;
3) 磺化花菁类染料易溶于水,对组织细胞毒性小,适用于动物和细胞实验;

4) 荧光波段在近红外区段的组织透过性更好。

 
 
标记反应操作
 
 

以 NHS 活化脂 CY 标记蛋白为例,如下图所示:

 

图 3. CY 标记蛋白操作流程
将蛋白溶液与配置好的染料工作液倒入反应溶剂中 → 用移液器上下轻打混匀 → 常温下静置或轻微混动反应 3-5 个小时 (可过夜) → 反应结束后进行透析除去未标记染料 → 避光放置在 4°C 保存
Product
Name
λex/
λem
Description

Cy2

488/520

是一种花青染料,可标记多肽,蛋白和寡核苷酸种的氨基。

Cy2-SE (iodine)

488/520

Cy2-SE (iodine) 为 Cy2 的 SE 修饰所得,可标记多肽、蛋白和寡核苷酸中的氨基。

Cy3-N3

555/580

Cy3 (Cyanine 3) 是一种发橘黄色荧光的花青素荧光染料。可以用 530nm-561nm 的激光束激发后用 TRITC 的滤片观察。

Cy 3 Non-Sulfonated

555/580

Cy3-N3 是 Cy3 叠氮化物荧光染料,用于多肽、蛋白和寡核苷酸中的氨基。

Cy3-YNE

555/580

CY3-YNE (Sulfo-Cyanine3-alkyne) 是一种染料,可用于标记可溶性蛋白、肽和寡核苷酸/ DNA。

Cy5

659/670

Cy5 是明亮的红色荧光染料,用于标记肽,蛋白质,寡核苷酸的氨基基团的反应染料。

Cy5-SE

659/670

Cy5-SE (Cy5 NHS Ester) 是一种用于标记肽,蛋白质,寡核苷酸的氨基基团的反应染料。

Cy5.5

673/707

Cy5.5 (Sulfo-Cyanine5.5) 是用于标记生物分子的近红外荧光染料,可用于小动物体内成像,也常常适用于对背景荧光干扰的实验。

Cy5.5-SE

673/707

Cy5.5-SE (Cyanine5.5 NHS ester) 为 CY5 的 NHS 修饰所得,可标记多肽、蛋白和寡核苷酸中的氨基。

Cy7-SE

720/790

CY7-SE (Sulfo-Cyanine7 Succinimidyl Ester) 是一种近红外荧光标记试剂,常用于小动物体内成像,也用来标记核酸,蛋白,多肽,纳米粒,多聚物等。

MCE 的所有产品仅用作科学研究或药证申报,我们不为任何个人用途提供产品和服务。

 
 

参考文献

 

 

1.X Shi, Y Jung, LJ LinC LiuC WuIKO CannQuantitative fluorescence labeling of aldehyde-tagged proteins for single-molecule imaging Nat Methods. 2012 Apr 1;9(5):499-503

2. JE Noble, E Cerasoli.Fluorescent labeling of protein analysis.

3. Arindam Pramanik, Zexi Xu, Shazana H Shamsuddin, et al. Affimer Tagged Cubosomes: Targeting of Carcinoembryonic Antigen Expressing Colorectal Cancer Cells Using In Vitro and In Vivo Models. ACS Appl Mater Interfaces. 2022 Mar 9;14(9):11078-11091.