原位杂交技术

使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与细胞、保存的组织切片或整个组织中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的 DNA 或 RNA 分子。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

挑选载玻片并在室温下干燥至少 30 分钟，将载玻片用 4% PFA 固定在摇床/摇床上 (最佳结果：4°C 过夜，室温 1 小时也可以)。

1. 预杂交和杂交

制备 2.3% (偏)碘酸钠，预杂交溶液 (配制并预热至 60°C)，0.1 M Tris pH 7.5 (准备清洗和硼氢化物 - 暂不添加硼氢化物)，将蛋白酶 K 缓冲液预热至 37°C，20% 醋酸。

1) 在高压灭菌水中短暂冲洗 3 次 (快速冲洗，几秒钟，无计时器)。保存 4% PFA 冷藏用于第 11 步。

2) 在摇床上于室温下在 2.3% (偏)碘酸钠溶液中孵育 5 分钟。

3) 在高压灭菌水中短暂冲洗 3 次。

4) 在摇床上于室温下在 20% 乙酸中孵育 5 分钟。

5) 在高压灭菌水中短暂冲洗 3 次。

6) 在 0.1 M Tris pH 7.5 中冲洗 1 次。

准备硼氢化钠溶液。

7) 在 1% 硼氢化钠 (溶解在 0.1 M Tris pH 7.5 中) 中孵育 5 分钟。

8) 在高压灭菌水中短暂冲洗 4 次。通过在 50 mL 蛋白酶 K 缓冲液 (在 37 ℃ 下预热) 中稀释 10 μL 蛋白酶 K 库存溶液 (10 mg/mL，储存于 -20 ℃) 来制备蛋白酶 K 溶液。 摇匀。

9) 在蛋白酶 K 中于 37°C 孵育 5 分钟。

10) 用 PBS（首选）或高压灭菌水冲洗 3 次。

11) 在 4% PFA（从初始固定步骤中保存）中室温孵育 5 分钟。

12) 在高压灭菌水中短暂清洗 3 次。

13) 在预杂交溶液中于 60°C 孵育 2X 5 分钟在溶液中孵育一次，倒出，再次孵育。 在此步骤中，准备探针。 将杂交混合物预热至 60°C。 在杂交混合物中将地高辛标记的 RNA 稀释至 1ng/μL。 每张玻片准备 100-150 μL。 确保溶液混合均匀。

14) 从罐子中取出载玻片，用纸巾轻拍边缘以轻轻干燥。 在每张玻片的杂交混合物中添加约 100μL 探针。杂交混合物可以直接滴加到每个切片上。动作要快，以免切片完全干燥。

15) 轻轻盖上玻璃盖玻片。小心放置盖玻片以避免气泡。

16) 将废预杂交混合物（或 1X 盐溶液中的 50% 甲酰胺）填充到载玻片底部腔室。

17) 小心地将载玻片放入腔室中，不要干扰盖玻片。

18) 将室密封在塑料袋中并在 60°C 下孵育过夜。

2. 杂交后

100 mL 50% 甲酰胺的 1x 盐溶液（与预杂交溶液相同）。 使用前加热至 60°C。

100 mL 0.5X 盐溶液（5 mL 10X 盐溶液 + 95 mL 高压灭菌水）。 温热至 60℃。

1) 小心地取下盖玻片在预杂交溶液中漂浮，或非常轻轻地从一角提起。将载玻片转移回惠顿罐。

2) 在 50% 甲酰胺的 1x 盐溶液中洗涤 2X 1 小时（总共 2 小时），60°C 保存甲酰胺废物以供下次使用。

3) 在 65℃ 的 0.5X 盐溶液中洗涤 2 次，每次 1 小时（总共 2 小时）利用这段时间准备封闭液。 储存于 4℃ 直至准备就绪。 最多可保存 1 周。

4) 在室温下用 1X TBS pH 7.5 清洗 2X 15 分钟。

5) 在封闭液中室温封闭1小时。用 dH₂O 填充载玻片腔室底部，用纸巾轻拍玻片边缘以使其干燥，用免疫组化笔勾勒出截面，每切片添加 40-50 μL 封闭液

6) 在封闭液中稀释抗 Dig-AP抗体，过夜孵育为 1:1000（周末以上为 1:2000），每部分准备约 50 μL

7) 除去封闭液，加入用封闭液稀释的抗体。 底部带水储存于 4°C 的容器中。

3. 准备 NTMT 溶液 (200 mL) 将 25 mg 盐酸四咪唑溶解在 50 mL NTMT 中

1) 将载玻片转移回惠顿罐，用胶带封住抗体溶液。

2) 在室温下在摇床上用 1X TBS pH 7.5 清洗 6X 30 分钟。

3) 用四咪唑在 NTMT 中洗涤 15 分钟。

4) 在不含四咪唑的 NTMT 中清洗 2 次，每次 15 分钟，在第二次洗涤完成之前，将 500 μL NBT/BCIP 溶液稀释在 49.5 mL NTMT 中

5) 倒出第 2 次洗涤液。 添加 NTMT 和 NBT/BCIP。用封口膜覆盖并用箔纸包裹惠顿罐以避光。

6) 监测颜色反应。在 10 分钟、30 分钟、1 小时、2 小时等时检查，直至显色。一些低丰度探针需要很长时间才能开发。 这些可能需要在 4°C 或室温下放置过夜。 此步骤差异很大，需要结合实际探针。

7) 通过在 1X TBS 中洗涤 2X 5 分钟来终止反应如果执行后续免疫检测，请改为用 1X PBS 清洗并跳过以下步骤。

8）通过乙醇、二甲苯系列脱水。水、水、75% 乙醇、95% 乙醇、100% 乙醇、100% 乙醇、二甲苯（或替代品）、二甲苯（或替代品）、二甲苯（或替代品）。在该系列的每一步中。短暂浸入玻片 10 次。

9) 用 Permount 盖玻片。

1.始终将 Sense 探针与反义探针并行运行，以确保反应的特异性。

2.所有步骤 1 和 2 都应（理想情况下）在无 RNase 的条件下进行。

3.与许多 NBT/BCIP 试剂不同，这种颜色产品通过乙醇/二甲苯脱水和封固程序是稳定的。然而，它可能会在储存几个月后褪色，并可能出现一些结晶沉淀。