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实验操作 | 表观遗传学: 染色质免疫沉淀 (ChIP) 检测知多少？

 

 

 

前期我们为大家介绍了表观遗传学哪些事儿，本期为大家介绍一种检测表观遗传调控因子与 DNA 之间的相互作用的强大技术--染色质免疫沉淀 (ChIP)！

 

 

01
染色质免疫沉淀
CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION

表观遗传学：在“非 DNA 序列变化”情况下，遗传信息通过某些机制或途径传递给子代表观遗传现象的机制或途径。目前表观遗传学相关的的检测方法主要包括染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)、质谱法、CUT&Tag 技术等[1][2]。

染色质免疫沉淀，通常又被称为 ChIP，是一种用于研究蛋白质与基因组 DNA 特定区域的相互作用的技术[3]。ChIP 可选择性地检测组蛋白、组蛋白修饰、转录因子，以提供有关染色质状态和基因转录的信息。

 
1. CHIP 原理

如图 1 所示，常见的 ChIP 检测过程：DNA 和蛋白质可通过甲醛可逆地交联 (可被热逆转)，以共价的方式将蛋白质附着在目标 DNA 序列上。通过进行超声处理或核酸酶处理以获得小 DNA 片段。使用针对目标 DNA 结合蛋白的特异性抗体进行免疫沉淀。从蛋白质中释放 DNA 后，使用各种方法 (PCR、q-PCR、测序等) 获得蛋白质与 DNA 相互作用的分析。

图 1. CHIP 实验流程图[3]。

 

 
2. CHIP 实验流程

CHIP 技术的基本步骤包括固定、超声处理、免疫沉淀、DNA 的分离纯化和 CHIP DNA 的分析[4]。

 

(1) 固定：

该技术的第一步是将 DNA-蛋白质复合物固定。甲醛是最常用的交联剂，其优点是能够使得 DNA-蛋白质紧密结合，且易于逆转。将 1% 甲醛添加到细胞培养瓶或板中的培养基中。固定结束后，加入 0.125 M 甘氨酸终止反应。

 

注意事项：

甲醛交联的最佳条件需要通过预实验确定或文献参考。通常，核小体蛋白交联得更快，非组蛋白则需要更长的孵育时间。如果时间过短会导致固定不足，DNA 片段过小，不利于后续的免疫沉淀分析。固定时间太长则会导致染色质难以切断。

 

(2) 超声处理：

将样品进行多次超声处理循环，将 DNA 破碎成 100–500 bp 的片段。影响超声处理的因素包括样品体积、超声处理探针的深度、超声处理强度和超声处理的持续时间。

 

注意事项：

一般来说样品体积不应超过 1.0 mL，如果将样品置于微量离心管中，探针应插入至少 1.0 cm 的深度，因为染色质溶液中含有十二烷基硫酸钠 (SDS)，可能会导致其起泡并导致超声处理效率降低。此外还需要注意样本需要放置在冰上，保持低温环境。

 

(3) 免疫沉淀：

免疫沉淀是 CHIP 中最重要的步骤，将目的蛋白的特异性抗体固定在磁珠上，与蛋白质－DNA 复合物充分混悬，在磁力架上孵育过夜，离心去上清后得到蛋白质－DNA 复合物。

 

注意事项：

兔来源的抗体对 Protein A 和 Protein G 具有相同的结合亲和力，而山羊来源的抗体更适合选择 Protein G。

 

(4) CHIP DNA 的分离：

将磁珠放入 250 μL 1% SDS 和 0.1 M NaHCO3 中室温孵育 15 min  来洗脱免疫沉淀的 DNA。将洗脱的蛋白质-DNA 复合物在 68°C 下孵育 6 小时至过夜以逆转甲醛交联，然后在 55°C 温度下用 200 mM NaCl、10 mM EDTA (pH 8.0)、40 mM Tris-HCl (pH 6.5) 和 50 μg/mL 蛋白酶 K 孵育 50 小时以消化蛋白质。接着用苯酚-氯仿-异戊醇混合物 (苯酚:氯仿:异戊醇比例为 25：24：1) 提取 DNA。为了去除可能残留的盐，确保 CHIP DNA 尽可能的纯净，可以使用预冷过的 70%  乙醇洗涤 ChIP DNA，风干，接着使用双蒸水或 TE 缓冲液（pH 8.0）重悬 CHIP DNA。

 

(5) 免疫沉淀后分析：

分离出目标 DNA 后，存在许多检测和定量方法可用于研究分离的基因片段。最常用的方法包括 PCR、q-PCR、DNA 微阵列杂交 (ChIP-chip)、和高通量测序 (ChIP-seq)。

 

表 1. 三种 CHIP DNA 分析方法的比较[5]。

 

 

02
CHIP 实验案例分析
CHIP EXPERIMENT CASE STUDY
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1. 案例一

文献标题

METTL14-mediated N6-methyladenosine modification of SOX4 mRNA inhibits tumor metastasis in colorectal cancer. 

 

研究背景

  • METTL14 是一种关键的 RNA N6-腺苷甲基转移酶，在 CRC 组织中的表达显著下调，并与不良预后相关。

  • H3K4me3 在 METTL14 启动子区域的富集在结直肠癌 (CRC) 细胞中显著降低，而 KDM5C 介导的 H3K4me3 去甲基化抑制了 METTL14 的转录。

 

研究目的

通过 ChIP 实验探究 KDM5C 是否直接结合到 METTL14 的启动子区域，并导致 H3K4me3 水平的变化，从而抑制 METTL14 的转录。

 

CHIP 实验操作

(1) 作者使用 KDM5C 抑制剂 (KDM5A-IN-1) 处理人结直肠癌 (CRC) 细胞系 HCT116 和 HCT8。

(2) 收集处理后的 CRC 细胞，使用超声破碎染色质，生成 200-500 bp 的 DNA 片段。

(3) 使用 KDM5C 抗体、H3K4me3 抗体，非特异性 IgG 作为阴性对照，进行免疫沉淀。

(4) 将细胞裂解液与抗体和蛋白质 A/G 孵育过夜，以获取与抗体特异性结合的染色质片段。

(5) 接着使用试剂盒洗脱并纯化 DNA。

(6) qPCR 实验分析 KDM5C 和 H3K4me3 在 METTL14 启动子区域的结合情况。

 

CHIP 实验结论

实验结果表明 KDM5C 能够直接与 METTL14 启动子区域结合，并通过去甲基化 H3K4me3 来抑制 METTL14 的转录从而影响 CRC 的进展。

 

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图 2. KDM5C 介导的 H3K4me3 去甲基化抑制了 METTL14 转录[6]。

a. CRC 细胞和结直肠组织 METTL14 位点的 H3K4me3 ChIP-Seq 数据分析。b. 采用 qRT-PCR 检测 KDM5A-IN-1(5 μM) 处理的 HCT116 和 HCT8 细胞中 METTL14 的 mRNA 水平。c . KDM5A-IN-1(5 μM)处理后，用 Western blot 检测 HCT116 和 HCT8 细胞中 METTL14 和 H3K4me3 的蛋白水平。d. 采用 Western blot 确定 HCT116 和 HCT8 细胞中蛋白水平的 KDM5C 敲低效率。e .采用 Western blot 检测 HCT116 和 HCT8 细胞中 METTL14 和 H3K4me3 的蛋白水平。f.采用 ChIP 测定法测量 KDM5C 缺乏或对照 HCT116 和 HCT8 细胞中  KDM5C 结合 f 的水平和 METTL14 启动子处 H3K4me3 g 的富集。

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2. 案例二

文献标题

Thiostrepton induces ferroptosis in pancreatic cancer cells through STAT3/GPX4 signalling.

 

研究背景

  • 谷胱甘肽过氧化物酶 4 (Glutathione Peroxidase 4, GPX4) 可通过将脂质过氧化物转化为无毒的脂质醇来抑制铁死亡。

  • Thiostrepton (TST) 能够降低胰腺癌细胞的活力，且伴随着细胞内铁超载、活性氧 (ROS) 积累、丙二醛 (MDA) 过表达和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX) 的耗竭。

  • STAT3/GPX4 信号通路在铁死亡的调节中起着关键作用：STAT3 能够结合到 GPX4 启动子区域并促进其转录。

 

研究目的

TST 是否能够通过调节 STAT3 来阻断 GPX4 的表达？为了深入理解 TST 如何在分子水平上调节 STAT3/GPX4 信号通路，进而影响铁死亡，研究者采用了染色质免疫沉淀 (ChIP) 实验。

 

CHIP 实验操作

实验中，作者首先使用 JASPAR (http://jaspar.genereg.net/) 网站预测了 STAT3 在 GPX4 启动子上的潜在结合位点。随后通过 ChIP-qPCR 实验来确认这些位点。

(1) 在 HEK293T 细胞铺板长满至 90% 后，作者使用交联试剂处理进行固定。

(2) 用 SDS 缓冲液裂解细胞后，使用超声将 DNA 破碎成 100-500 bp 的片段。

(3)  接着使用针对 STAT3 的 特异性抗体和正常小鼠 IgG 作为对照，沉淀与 STAT3 结合的 DNA 片段。

(4)  经过洗涤、DNA 的洗脱和解交联后，使用 qPCR 检测所富集导的序列。

 

CHIP 实验结论

ChIP 实验的结果证实了 STAT3 可以直接与 GPX4 的启动子区域 (P2) 结合，而非其他预测的结合位点 (P1、P3 和 P4)。TST 通过调节 STAT3 的表达和活性来影响 GPX4 的转录从而促进铁死亡，为胰腺癌的治疗提供了新的策略。

 

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图 3. TST 激活 STAT3–GPX4 信号通路[7]。

a-b. 蛋白质印迹和 qRT-PCR分析。胰腺癌中 STAT3 过表达引起的 GPX4 表达变化。c-d.  JASPAR 预测了一个保守的 STAT3 结合基序，并显示了 GPX4 启动子中潜在 STAT3 结合位点的示意图。e. ChIP 分析 Panc - 1 细胞中 GPX4 启动子上 STAT3 的占有率。f. GPX4 启动子区域含有 STAT3 结合位点 (WT 和 MUT) 的荧光素酶报告质粒的示意图。g. 过表达 STAT3 并转染含有 WT 和 MUT GPX4 启动子的报告质粒的 293T 细胞的荧光素酶报告检测。

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03
小结
conclusion
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表观遗传学不仅有助于理解基因表达的调控机制，同时也为疾病的预防、诊断和治疗提供了新的视角。通过筛选能够影响特定表观遗传修饰的化合物，可以帮助研究人员可以发现潜在的治疗靶点，进而开发出新的药物！

 

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[1] Yuan ZF, et al. Mass spectrometric analysis of histone proteoforms. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 2014;7(1):113-28. Epub 2014 Jun 2.

[2] Fu Z, et al. Cut&tag: a powerful epigenetic tool for chromatin profiling. Epigenetics. 2024;19(1):2293411.

[3] DeCaprio J, Kohl TO. Chromatin Immunoprecipitation. Cold Spring Harb Protoc. 2020;2020(8):098665. Published 2020 Aug 3.

[4] Das PM, et al. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 2004;37(6):961-969.

[5] Li Y. Modern epigenetics methods in biological research. Methods. 2021 Mar;187:104-113.

[6] Chen X, et al. METTL14-mediated N6-methyladenosine modification of SOX4 mRNA inhibits tumor metastasis in colorectal cancer. Mol Cancer. 2020;19(1):106. Published 2020 Jun 17.

[7] Zhang W, et al. Thiostrepton induces ferroptosis in pancreatic cancer cells through STAT3/GPX4 signalling. Cell Death Dis. 2022 Jul 20;13(7):630.

 

 

 
 

 

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