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干货分享 | 小心!细胞又又又又又支原体污染了?

 

 
你的细胞培养,一切正常吗? 外形健康的细胞,可能正遭受致命杀手的威胁 — 支原体污染!它会悄无声息地影响实验结果,甚至毁掉你的研究 。今天,我们就来聊聊如何识别、预防和应对这种“细胞致命杀手”。
 
 
01
什么是细胞支原体污染?
 

细胞培养在生物医药研究中已成为一种基本、频繁的工具。因此,保持细胞培养物无菌至关重要。虽然不同的微生物 (细菌、真菌、酵母或病毒) 能够污染细胞培养物,但软壁菌门 (Mollicutes支原体 (Mycoplasma) 是污染的根本原因[1]

支原体是一类独特的细菌菌株,在分类学上属于 Mollicutes,已知有 190 多种支原体分布于人类、动物、昆虫和植物中;其中仅 8 种就造成了约 95% 的细胞培养污染事件[2]支原体属微生物具有对抗菌药物高度耐药、代谢慢、缺乏刚性细胞壁、体积小 (0.3 ~ 0.8 µm)、柔韧性强等特点,能通过常用的抗菌过滤器 (0.45 µm)[3][4]。这些微生物生长缓慢,最佳条件下也会有很长的潜伏期。
图 1. 典型支原体菌落,具有经典的“煎蛋”形态[5]。 

由于其有限的生物合成能力和对真核细胞的强制性依赖,支原体必须从从培养基和真核细胞的代谢中获取营养,其还能改变细胞的代谢和功能,导致细胞生长速率异常、活力下降、易脱壁等。此外,支原体还可能吸附在细胞表面,破坏细胞膜的完整性,影响细胞间的信号传递。因此会对细胞生理学和实验结果产生重大影响。

图 2. 非洲绿猴肾 (VERO) 细胞的扫描电子显微照片[6]

(a) 未感染细胞;(b-d) 感染发酵支原体 (M.fermentans) 的细胞。

 

 

02
如何检测细胞支原体污染?
 
由于支原体污染不易被肉眼观察到,因此需要借助一些检测方法来确认。目前已开发出多种检测细胞培养中支原体污染的方法,包括直接培养法、DNA 染色法、基于酶联免疫吸附试验 (ELISA) 的方法以及 PCR 检测法等[7]。其中,PCR 检测因其高灵敏度和快速性而被广泛使用。
注:检测方法各有优缺点,通常需要根据实验的具体需求和条件进行评估。

(一) 细胞培养方法

细胞被支原体污染后,培养液一般会浑浊。将细胞培养于特定的细胞培养液中,可观察培养基上支原体集落形成情况。该方法需要花费时间,但可以直接观察培养基变色情况。

(二) DNA 荧光染色法

DNA 荧光染色法是一种检测支原体的常见实验技术。该方法涉及将待测样本与 Vero 细胞 (一种细胞质较大的细胞) 共培养,通过使用荧光染料 (例如 Hoechst 染料) 对细胞 DNA 进行染色,如果样本中存在支原体,可以在 Vero 细胞核周围、细胞膜周围以及培养基中观察到荧光斑点或颗粒。相较于分离培养法,DNA 荧光染色法能更准确地检测支原体菌株。然而,死亡细胞释放的 DNA 可能会干扰检测结果,导致误判率约为 30%。

图 3. 感染/未感染的支原体示意图[8]

上图为感染支原体的 COS7、NB4、MG63、EL4、Saos2 和 Vero 细胞株 (阳性对照)。下图为未感染支原体 (阴性对照) 的 B95.8、A549、Nalm6、CHO、Vero和 NSO 细胞株的间接 DNA DAPI 染色结果。

(三) PCR 检测

PCR 技术是检测支原体感染的一种高灵敏度方法。该技术以针对支原体 16S rRNA 基因的保守序列为特异性引物,通过 PCR 扩增可疑样本中的 DNA。如果凝胶电泳过程中出现支原体 DNA 特定条带,表明支原体存在。PCR 技术能够识别所有类型的支原体,但无法区分支原体是活体还是死亡状态。同时,实验操作过过程中,源于实验器材、枪头、管壁等物品上残留的微量支原体 DNA 均易产生假阳性风险。

图 4. 支原体污染样本的 PCR 分析[7]

从左到右:1 泳道,Trans2K DNA 阶梯;2-5 泳道,Myla 细胞样本;6 泳道,NK92 细胞样本;7-11 泳道,Jurkat 细胞样本;12 泳道,阳性样本;13 泳道,阴性样本 (PBS)。阳性对照和抑制样本均显示 270 bp 带,存在支原体污染,而阴性对照未显示任何可观察到的带。

 

03
消除细胞培养中的支原体污染
 
一旦检测到支原体,那就只有两种招数了。要么重新开始,要么选择从培养物中消除污染。

由于细胞系的重要性或稀缺性,通常会选择消除支原体污染。其操作流程大致如下:

图 5. 去除支原体的过程[7]

BM-Cyclin 是一种商业药剂,可在不影响细胞状态的前提下,有效抑制和清除在细胞培养中广泛存在的支原体污染。

▐  使用 BM-Cyclin (HY-K1059, 7.5 mg)  消除支原体污染。

01

BM-Cyclin 储存液配制:将 5 mg BM-Cyclin-1 和 2.5 mg BM-Cyclin-2 分别用 2 mL 无菌 PBS 或无菌 ddH2O 溶解,即得 250× 储存液。BM-Cyclin-1 储存液浓度为 2.5 mg/mL,BM-Cyclin-2 储存液浓度为 1.25 mg/mL。

02

 

BM-Cyclin 工作液配制BM-Cyclin-1 工作浓度为 10 μg/mL,BM-Cyclin-2 工作浓度为 5 μg/mL。如将 4 μL BM-Cyclin-1 储存液加入 1 mL 新鲜培养基中即得含 10 μg/mL BM-Cyclin-1 的新鲜培养基,将 4 μL BM-Cyclin-2 储存液加入 1 mL 新鲜培养基中即得含 5 μg/mL BM-Cyclin-2 的新鲜培养基。

03

当培养皿中的细胞达到 90% 汇合度时,用胰蛋白酶消化细胞 (贴壁细胞),加入新鲜培养基终止消化,收集细胞。转移至离心管中,1,000 rpm 的速度离心细胞 3-5 分钟。

04

除去上清液并将细胞重新悬浮于含 10 μg/mL BM-Cyclin-1 的新鲜培养基中,孵育 3 天。弃去培养基,加入含 5 μg/mL BM-Cyclin-2 的新鲜培养基,孵育 4 天。以上为一个周期,再重复操作 1 次。

05

后续可用 DAPI (HY-D0814,本试剂盒未提供) 等检测支原体清除效果。

 

 
 

 注意事项:

1. 对于部分敏感细胞,建议将工作浓度减半,并处理 3 个周期。

2. 若经 2 个周期处理后,支原体未清除完全,建议将工作浓度增加 50% 后再处理一个周期。

3. 请按顺序使用 BM-Cyclin-1 和 BM-Cyclin-2 处理细胞,切勿同时使用。

4. 不建议与其他抗生素混合使用。

5. 为避免反复冻融,建议稀释前先分装储存液。

6. 疑似污染细胞避免与正常细胞一起操作,以免造成交叉污染。

7. 本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗。

8. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

 
 

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04
细胞支原体污染的来源及防治措施
 

 

 
 
支原体消除失败的主要原因之一是细胞内没有抗生素,一些支原体会躲藏在细胞内并逃避治疗。然后,它们会在一段时间后暴露出来。由于从细胞中消除支原体比较麻烦,因此仅当细胞很有价值并且不可能再次提供时才建议用抗生素治疗被支原体污染的细胞。
去除支原体的最佳方法是丢弃受污染的细胞。由于支原体很小,在过滤过程中施加高压时可以通过过滤器孔逃逸,因此对于细胞培养的材料和补充剂,建议选择使用伽马射线和紫外线照射组合净化胰蛋白酶和 FBS 的公司。此外,一定要对污染的培养箱和实验区域进行彻底的清洁和消毒
产品推荐
 
BM-Cyclin (HY-K1059)

支原体清除试剂

Penicillin-Streptomycin (100×), Sterile (HY-K1006)

青霉/链霉素双抗溶液 

Gentamicin-Amphotericin B (500×), Sterile (HY-K1008)

庆大霉素/两性霉素 B 双抗溶液

Tetracycline (HY-A0107)

广谱抗生素,对支原体有活性 

 
 
Tiamulin (HY-B2060)

二萜类抗生素,可用于支原体感染引起的气囊炎研究

 
[1] Weiskirchen S, et al. A Beginner's Guide to Cell Culture: Practical Advice for Preventing Needless Problems. Cells. 2023 Feb 21;12(5):682.
[2] Becherucci V, et al. A practical approach for gmp-compliant validation of real-time PCR method for mycoplasma detection in human mesenchymal stromal cells as advanced therapy medicinal product. Biologicals. 2021 Sep;73:31-40.
[3] Uphoff CC, Drexler HG. Detection of Mycoplasma contamination in cell cultures. Curr Protoc Mol Biol. 2014 Apr 14;106:28.4.1-28.4.14. 
[4] Uphoff CC, Drexler HG. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2002 Feb;38(2):79-85. 
[5] Young L, Sung J, Stacey G, Masters JR. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nat Protoc. 2010 May;5(5):929-34. 
[6] Shlomo Rottem, Michael F. Barile. Beware of mycoplasmas,Trends in Biotechnology,Volume 11, Issue 4,1993,Pages 143-151.
[7] Huang X, et al. Prevention, Diagnosis and Eradication of Mycoplasma Contamination in Cell Culture. J Biol Methods. 2023 Nov 1;10:e99010005.
[8] Molla Kazemiha V, et al.. Real-time PCR assay is superior to other methods for the detection of mycoplasma contamination in the cell lines of the National Cell Bank of Iran. Cytotechnology. 2016 Aug;68(4):1063-80.