Janelia Fluor® 646, SE  (Synonyms: JF646, SE; JF646, NHS)

Janelia Fluor 646, SE (JF646, SE) is a red fluorescent dye can be used in cellular imaging^[1]. Janelia Fluor products are licensed under U.S. Pat. Nos. 9,933,417, 10,018,624 and 10,161,932 and other patents from Howard Hughes Medical Institute.

激发波长最大值 = 646 nm；发射波长最大值 = 664 nm^[1]。
JF646 可作为自标记标签 (例如 HaloTag) 的配体^[1]。
Janelia Fluor 646, SE (JF646, SE) 由 JF646 修饰而成。JF646 是一种红色荧光染料，具有光稳定性、膜渗透性和高消光系数^[2]。
Protocol
一、蛋白制备
1) 为获得最佳标记效果，请制备蛋白 (抗体) 浓度为 2 mg/mL。
2) 蛋白溶液的 PH 值为 8.5±0.5。如果 pH 值低于 8.0，应使用 1 M 碳酸氢钠进行调节。
3) 如果蛋白浓度低于 2 mg/mL，标记效率会大大降低。为获得最佳标记效率，建议终蛋白浓度范围为 2-10 mg/mL。
4) 蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 的缓冲液中，并且铵离子，否则会影响标记效率。
2.染料制备
将无水 DMSO 加入 Janelia Fluor® 646, SE 小瓶中，制成 10 mM 储备液。通过移液器或涡旋混合均匀。
3.染料用量的计算
反应所需的 Janelia Fluor® 646, SE 的量取决于待标记蛋白的量，Janelia Fluor® 646, SE 与蛋白的最佳摩尔比为 10 左右。
Example：假设所需的 marker protein 为 500 μL 2 mg/mL IgG (MW=150,000)，用 100 μL DMSO 溶解 1 mg Janelia Fluor® 646, SE，得到所需的 Janelia Fluor® 646, SE 体积为 3.98 μL，详细计算过程如下：
1) mmol (IgG) =mg/mL (IgG) ×mL (IgG)/MW (IgG) =2 mg/mL × 0.5 mL/150,000 mg/mmol= 6.7×10^-6 mmol
2) mmol (Janelia Fluor® 646, SE) =mmol (IgG) × 10=6.7×10^-6 mmol×10=6.7 × 10^-5 mmol
3) μL (Janelia Fluor® 646, SE) = mmol (Janelia Fluor® 646, SE) ×MW (Janelia Fluor® 646, SE)/mg/μL (Janelia Fluor® 646, SE) =6.7 ×10^-5 mmol ×593.70 mg/mmol/0.01 mg/μL=3.98 μL (Janelia Fluor® 646, SE)
4.运行偶联反应
1) 将适量新鲜制备的 10 mg/mL Janelia Fluor® 646, SE 缓慢加入到 0.5 mL 蛋白质样品中
在溶液中，轻轻摇动混匀，然后短暂离心，将样品收集在反应管底部。请勿混匀，以免蛋白样品变性失活。
2) 将反应管置于避光处，在室温下间隔轻轻孵育 60 分钟。10-15 分钟，轻轻逆转反应
5.纯化偶联物
以下方案是使用 SepHadex G-25 柱纯化染料-蛋白偶联物的示例。
1) 根据制造说明准备 SepHadex G-25 柱。
2) 将反应混合物加载到 SepHadex G-25 柱的顶部。
3) 一旦样品在顶部树脂表面下方运行，立即添加 PBS (pH 7.2-7.4)。
4) 向所需样品添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱纯化。合并含有所需染料-蛋白质偶联物的级分。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

593.70

C₃₃H₃₁N₃O₆Si

1811539-59-9

固体

Light green to green

646

606

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

-20°C, protect from light

*In solvent : -80°C, 6 months; -20°C, 1 month (protect from light)

* 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
储备液的保存方式和期限：-80°C, 6 months; -20°C, 1 month (protect from light)。-80°C储存时，请在6个月内使用，-20°C储存时，请在1个月内使用。

• [1]. Grimm JB, et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat Methods. 2015;12(3):244-250. doi:10.1038/nmeth.3256  [Content Brief]

  [2]. Basu S, et al. FRET-enhanced photostability allows improved single-molecule tracking of proteins and protein complexes in live mammalian cells. Nat Commun. 2018;9(1):2520. Published 2018 Jun 28.  [Content Brief]