PKH 67 

PKH67 is a fluorescent cell binding dye with green fluorescence. PKH67 can stain the cell membrane and the Ex/Em is 490/502 nm. PKH67 is often used in combination with the non-specific red fluorescent dye PKH26 (Ex/Em=551/567 nm) to label cells, detect cell proliferation in vitro, and trace cells in vitro and in vivo^[1][2].

胞葬试验中的细胞标记方案（以 Jurkat 细胞为例）^[1]：
1. 诱导细胞凋亡：在 RPMI-1640 培养基中加入 5 μg/mL Staurosporine (HY-15141)，在 37°C，5% CO² 条件下，以 2.5×10⁶ cells/mL 的密度孵育 3 h。
2. 标记细胞：用 1× DPBS 中清洗 Jurkat 细胞，并在含有 PKH67 (绿色荧光) 或 PKH26 (红色荧光) 的 Diluent C 中以 2×10⁷ 细胞/mL 的浓度重悬细胞。
3. 用含 10% HI-FBS 的 DMEM 基础培养基冲洗细胞两次。制备好的细胞应立即用于胞吐试验。
产品使用流程如下：

1. PKH 67 工作液的配制
1.1 用预热好的 Diluent C 按照 1:500 稀释 PKH 67 母液，即用 1 mL Diluent C 稀释 2 μL PKH 67 母液。
注：请根据实际情况调整 PKH 67 工作液浓度，且现用现配。
2. 细胞染色（悬浮细胞）
2.1 离心收集细胞，加入 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。细胞密度在1×10⁶/mL。
2.2 加入 1 mL PKH 67工作液，室温孵育 10-45 分钟。
2.3 400 g，离心 3-4 分钟，弃去上清。
2.4 加入 PBS 洗涤细胞两次，每次 5 分钟。
2.5 用 1 mL 无血清培养基或 PBS 重悬细胞后，使用荧光显微镜或流式细胞仪进行观察。
3. 细胞染色（贴壁细胞）
3.1 将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。
3.2 从培养基中移出盖玻片，吸除多余培养基。
3.3 加入 100 μL 染料工作液，轻轻晃动使其完全覆盖细胞，孵育10-45 分钟。
3.4 吸去染料工作液，用培养基洗2-3次，每次5 分钟 ，使用荧光显微镜进行观察。
4. 外泌体标记
4.1 以 200 μg 蛋白质/150 μL PBS 的外泌体为例，需加入 5-10 μL 染料工作液。
4.2 轻轻晃动使其完全覆盖在外泌体表面，室温避光孵育 30-60 min。
4.3 制备得到荧光标记的外泌体需要经过超滤或层析的方法除去过剩的染料。 超滤：通过 100 kD 超滤管进行离心分离纯化，离心条件为 20-25 ℃，7000-10000 g，15 min，重复 4 次，收集沉 淀。 离心柱层析：柱层析条件为 CORE400 填料，PBS 缓冲液（pH 7.4）作流动相；离心条件为 20-25 ℃，1000-2000 g 离心 1-3 min，收集沉淀。
4.4 收集纯化后样品，即为标记外泌体。
5. 注意事项
1. 请根据实际情况调整 PKH 67 工作液浓度。
2. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

257277-27-3

液体

Light yellow to yellow

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• [1]. Shi J, et al. A genome-wide CRISPR screen identifies WDFY3 as a regulator of macrophage efferocytosis. Nat Commun. 2022 Dec 24;13(1):7929.  [Content Brief]

  [2]. He L, et al. Intelligent manganese dioxide nanocomposites induce tumor immunogenic cell death and remould tumor microenvironment[J]. Chemical Engineering Journal, 2023: 141369.