5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside  (Synonyms: Bluo-Gal)

5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside (Bluo-Gal) is a chromogenic substrate for β-galactosidase. 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside is hydrolyzed by the enzyme to generate a 5-bromoindole intermediate, which is further oxidized to form an insoluble blue precipitate. 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside can specifically recognize bacterial β-galactosidases (such as the product of the Escherichia coli lacZ gene) and reacts at pH 7.4, making it suitable for light and electron microscopic observations. 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside can be used in histochemical detection of reporter gene expression in transgenic organisms, such as the localization analysis of β-galactosidase activity in mouse embryos or muscle tissues^[1][2].

5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside (1 mg/mL；3-4 h) 在 CD1/MlacZ 转基因小鼠胫骨前肌组织中，经 2.5% 戊二醛+1% 多聚甲醛固定 3 小时后，特异性显示 β-半乳糖苷酶活性，形成蓝色针状结晶沉积于细胞核周围及内部，非转基因小鼠对照无染色^[1]。

5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside 的使用示例^[1]
实验材料
1. 组织样本：转基因小鼠骨骼肌组织 (如胫骨前肌)，对照组为非转基因小鼠同部位组织。
2. 固定液：
- 配方：2.5% 戊二醛 (glutaraldehyde) + 1% 多聚甲醛 (paraformaldehyde)，溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液 (PBS，pH 7.4)。
- 其他测试配方：包括不同浓度戊二醛与多聚甲醛混合液，或单一醛类固定液。
3. 显色底物溶液：
- 1 mg/mL Bluo-Gal (溶于 DMSO，40 mg/mL 母液，-20°C 避光保存)。
- 10 mM 铁氰化钾 (K₃[Fe(CN)₆])
- 10 mM 亚铁氰化钾 (K₄[Fe(CN)₆])
- 2 mM MgCl₂
- 0.1 M PBS (pH 7.4)
4. 后固定液：1% 锇酸 (OsO₄)，溶于0.2 M colloidine buffer，pH 7.4。
5. 脱水试剂：梯度乙醇 (25%、50%、75%、95%、100%)、环氧丙烷 (propylene oxide)。
6. 包埋试剂：环氧树脂 (Epoxy resin)。
实验步骤
1. 组织固定
取材：迅速取材小鼠胫骨前肌，切成约 1-2 mm³ 小块。
固定条件：
- 将组织块浸入 2.5% 戊二醛+1% 多聚甲醛混合液，4°C 固定 3 小时 (最佳时间，避免过长固定导致酶活性下降)。
- 对照组 (非转基因小鼠) 同步处理，排除内源性 β-半乳糖苷酶干扰。
2. 漂洗
- 固定后，用 0.1 M PBS (pH 7.4) 漂洗组织 1 小时，去除残留固定液。
3. Bluo-Gal 显色孵育
- 底物配制：临用前将 Bluo-Gal 母液 (40 mg/mL DMSO) 稀释至 1 mg/mL，加入铁氰化钾、亚铁氰化钾和 MgCl2，混匀 (避光操作，防止底物分解)。
- 孵育条件：
- 组织浸入底物溶液，30-32°C 孵育 3-4 小时 (最佳显色时间，过夜孵育不影响染色强度，但无需延长)。
- 对照组 (不加底物) 同步孵育，验证无内源性活性。
4. 后固定 (电子显微镜观察用)
- 显色后组织用 1% 锇酸溶液 4°C 后固定 1 小时，增强结构对比度。
5. 脱水与包埋
- 梯度脱水：组织经 25%、50%、75%、95% 乙醇各 10-20 分钟，100% 乙醇两次 (每次 20 分钟)。
- 透明处理：环氧丙烷浸泡两次，每次 10-20 分钟 (避免过长时间导致反应产物溶解)。
- 包埋：环氧树脂包埋，60°C 聚合 24 小时。
6. 切片与观察
- 半薄切片 (光镜) ：切 0.5-1 μm 切片，微分干涉相差 (DIC) 显微镜观察，β-半乳糖苷酶阳性区域呈蓝色针状结晶。
- 超薄切片 (电镜) ：切 80 nm 切片，铀铅双染色，透射电镜观察酶活性产物的亚细胞定位。
关键参数与优化
1. 固定液选择：2.5% 戊二醛+1% 多聚甲醛混合液平衡酶活性保存与组织形态，优于单一醛类固定液 (表1)。
2. 孵育时间：3 小时固定+3-4 小时显色即可获得强蓝色沉淀，避免过度固定 (6-12 小时) 导致酶活性显著下降。
3. 对照实验：非转基因小鼠组织不加底物孵育，确认无背景染色。
4. 底物特性：Bluo-Gal 生成的 5-溴靛蓝沉淀为双折射针状晶体，比 X-Gal 更易在低倍镜下识别，且抗有机溶剂洗脱。
注意事项
- 避光操作：Bluo-Gal 母液及工作液需避光保存和使用，防止光降解。
- 温度控制：固定与孵育步骤均需在低温 (4°C) 或温和温度 (30-32°C) 下进行，避免酶活性丧失。
- 脱水时间：环氧丙烷处理时间不宜过长 (≤20 min)，减少反应产物溶解。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

374.18

Bluo-Gal

C₁₄H₁₆BrNO₆

97753-82-7

固体

White to off-white

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

4°C, protect from light

*In solvent : -80°C, 6 months; -20°C, 1 month (protect from light)

* 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
储备液的保存方式和期限：-80°C, 6 months; -20°C, 1 month (protect from light)。-80°C储存时，请在6个月内使用，-20°C储存时，请在1个月内使用。

• [1]. Gioglio L, et al. An improved method for beta-galactosidase activity detection on muscle tissue. A light and electron microscopic study. Ann Anat. 2002;184(2):153-157.  [Content Brief]

  [2]. Blanco MJ, et al. Tracing Gene Expression Through Detection of β-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos. J Vis Exp. 2018 Jun 26;(136):57785.  [Content Brief]