Primary antibody and secondary antibody eluent, specially for mIHC experiments  (Synonyms: 一抗二抗洗脱液（mIHC专用）)

Primary antibody and secondary antibody eluent, specially for mIHC experiments is an eluent used for mIHC (multiple immunohistochemistry).

一、切片处理
1. 冰冻切片处理
1.1 取出冰冻切片恢复至室温晾干水分后固定 10-30 min，PBS 洗 5 min 重复 3 次。
1.2 准备破膜滴加破膜液通透 20 min，PBS 洗 5 min 重复 3 次。
1.3 抗原修复，切片置于 EDTA 抗原修复缓冲液 (PH 9.0)中 60°C 水浴 30 min，自然冷却，PBS 洗 5 min, 重复 3 次。
注：修复可能因引起脱片，可选做，若成像背景较高再做该步骤处理。
1.4 阻断内源性过氧化物酶，切片放入 3% 过氧化氢溶液，室温避光孵育 25 min，将玻片置于 PBS (PH 7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5 min。
1.5 BSA 封闭，切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈 (防止抗体流走)，在圈内滴加用 3% BSA (或者其他封闭液) 均匀覆盖组织，室温封闭 30 min。

2. 抗体孵育
2.1 一抗孵育，轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗，切片平放于避光湿盒内 4°C 孵育过夜或者 37°C，1-2 h，注意不要让切片干燥。
2.2 二抗孵育，玻片置于PBS (PH 7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5 min。切片稍甩干后滴加二抗覆盖组织，避光室温孵育 50 min，PBS 洗三 次，每次 5 min。

3. 染色
使用 TSA 染料与 TSA buffer 按照 1:50-1:200 的比例混合均匀，切片滴加配好的 TSA 荧光染料反应液均匀覆盖组织室温反应 1-15 min (最佳时间 5 min-10 min)，PBS 洗三次，反应 2-15 min，PBS 洗三次。
注：建议先做预实验，可先染 1 min 洗干净荧光染料后显微镜下观察染色效果，如果阳性弱继续滴加荧光染料加强染色强度直至合适强度后继续进行下一 步。

4. 抗体洗脱
滴加适量37°C 预热至完全溶解的 Primary antibody and secondary antibody eluent, specially for mIHC experiments (HY-D2776) 覆盖样本，37°C放置 5-20 min，弃去洗脱液，重复一次，PBS 洗三次，每次 5 min。

5. DAPI 染色
重复染色建议从 1.4 开始，染色结束后滴加 DAPI 工作液到样本上，室温孵育 5 min。TBST 洗涤一次，用抗荧光淬灭封片剂封片。
注：长期保存建议用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。

二、细胞爬片染色
1. 细胞爬片样本处理
1.1 多聚甲醛固定 15 min，PBS 洗涤三次，每次 5 min，Tritonx100 破膜 15 min，PBS 洗涤三次，每次 5 min。
1.2 阻断内源性过氧化物酶，细胞孔板内滴加 3% 过氧化氢溶液，室温避光孵育 15 min，PBS (PH 7.4) 洗涤 3 次，每次 5 min。
1.3 BSA 封闭，细胞孔板内滴加用3% BSA-PBS (或者其他封闭液) 均匀覆盖细胞，室温封闭 30 min，洗掉。

2. 抗体孵育
2.1 加一抗，轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗，切片平放于避光湿盒内 4°C 孵育过夜或者 37°C，1-2 h，注意不要让切片干燥。
2.2，二抗孵育，玻片置于 PBS (PH 7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5 min。切片稍甩干后滴加二抗覆盖组织，避光室温孵育 50 min，PBS 洗三次，每次 5 min。

3. 染色
使用 TSA 染料与 TSA buffer 按照 1:50-1:200 的比例混合均匀，切片滴加配好的 TSA 荧光染料反应液均匀覆盖组织室温反应 1-15 min (最佳时间 5 min-10 min），PBS 洗三次，反应 2-15 min，PBS 洗三次。
注：建议先做预实验 可先染 1 min 洗干净荧光染料后显微镜下观察染色效果，如果阳性弱继续滴加荧光染料加强染色强度直至合适强度后继续进行下一 步。

4. 抗体洗脱
滴加适量 37°C 预热至完全溶解的 Primary antibody and secondary antibody eluent, specially for mIHC experiments (HY-D2776) 覆盖样本，37°C 放置 5-20 min，弃去洗脱液，重复一次，PBS 洗三次，每次 5 min。

5. DAPI 染色
染色结束后滴加 DAPI 工作液到样本上，室温孵育 5 min。TBST 洗涤一次，用抗荧光淬灭封片剂封片。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

液体

Colorless to light yellow

一抗二抗洗脱液（mIHC专用）

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

4°C, protect from light

*In solvent : -80°C, 6 months; -20°C, 1 month (protect from light)