蛋白翻译后修饰 (PTMs) 研究解决方案

蛋白翻译后修饰 (post-translational modifications，PTMs) 指的是在蛋白质氨基酸残基根据发育和生理时间尺度的要求动态通过添加或移除特定的基团进而调节蛋白活性、定位、表达以及与其他细胞分子相互作用的一种调控方式。PTMs包括磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂质化、棕榈酰化、氨甲酰化、豆蔻酰化和蛋白水解等，目前在哺乳类动物中发现有超过500种的修饰方法，不同修饰对于蛋白的有不同的作用^[1]。

PTMs是细胞信号传导中的重要组成部分，通过改变蛋白质构象、定位、活性、稳定性、电荷和与其他生物分子的相互作用，最终改变了细胞的表型和生物过程。小分子、脂质、碳水化合物和多肽也能被添加到氨基酸侧链上，形成修饰。因此深入研究蛋白质翻译后修饰对揭示生命活动的机理、筛选疾病的临床标志物、鉴定药物靶点等方面都具有重要意义。 修饰蛋白质组学作为一种分析工具，已经被科研工作者广泛应用。一个基于生物质谱经典的修饰组学研究思路主要包括以下五个部分：1. 富集修饰肽段，首先提取蛋白混合物并酶解成多肽混合物，然后富集修饰肽段；2. 质谱检测，利用质谱方法既可通过检测氨基酸残基上的分子质量偏移值确定翻译后修饰的类型，又可根据多肽在二级质谱中的裂解碎片推断修饰的精确位点；3. 生物信息学分析，利用数据库进行数据检索，进行差异的修饰蛋白分析；4. 确认表型，利用突变体、蛋白KD/KO、抑制剂等传统生物学方法进行体外功能实验；5. 确定表型的作用机制，探究互作的结构域、基序及修饰的位点对酶或底物作相应的突变或重组，进行体内验证^[2]。

经典的蛋白数据库：1. UniProt (The Universal Protein Resource)；2. PIR (Protein Information Resource)；3. BRENDA (enzyme database)。

经典的翻译后修饰相关数据库：1. PhosphoSitePlus：用于研究哺乳动物蛋白质翻译后修饰的综合信息和工具数据库；2. PTMD (PTM that are associated with human Disease)：该数据库从文献中搜集了不同PTM类型和不同疾病之间关系的研究证据；3. Prosite ：预测蛋白质初级结构、结构域、理化性质和翻译后修饰位点。

蛋白质及其 PTMs 可视化软件：1. PyMOL；2. AWESOME；3. Chimera。

1. 泛素化
泛素化是指泛素分子 (Ub, ubiquitin) 在泛素激活酶 (E1)、泛素结合酶 (E2) 和泛素连接酶 (E3) 的协同催化作用下特异性修饰靶蛋白的过程。同时，泛素化是一个被严格调控的可逆过程，去泛素化由去泛素酶 (DUB) 进行，泛素化与去泛素化是胞内与蛋白特异性降解相关的重要生理过程。首先，Ub的 C 端连接到 E1 的半胱氨酸残基，以 ATP 作为能量形成高能硫酯键激活 Ub。然后，E1将活化的Ub通过硫酯化反应共价连接到 E2 的半胱氨酸残基。最后，一些种类不同的 E3 将结合 E2 活化的 Ub 连接到底物蛋白质的赖氨酸残基上，不断重复上述过程，蛋白质泛素链化后使其被 26S 蛋白酶体识别并降解成小片段分解为多肽片段和重复使用的Ub。泛素化参与了细胞周期、凋亡、分化、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等生命活动的调控，因此，泛素化成为开发、研究药物的新靶点。

目前研究泛素化的方法包括针对酶或 26S 蛋白酶体基于活性的探针 (ABP)、基于Ub标签的实验、基于质谱的泛素化组学、蛋白泛素化检测 (IP-WB) 或Ub组合分数进行泛素化位点分析。

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2. SUMO化
SUMO (small ubiquitin-related modifier) 是近年来发现与泛素类似的蛋白质，可由类似泛素化的过程与目标蛋白质上特定的赖氨酸支链形成共价键而修饰蛋白质。在发生修饰前，前体SUMO分子被SUMO特异性蛋白酶加工切割，使其C末端暴露出2个甘氨酸残基 (Gly-Gly, GG)，形成可用于修饰的成熟形式的SUMO分子SUMO-GG。与蛋白泛素化相似，成熟的SUMO蛋白与一个SUMO化激活酶 (E1) 结合，以ATP依赖的方式形成硫酯键。然后 SUMO被转移到 E2 (Ubc9)，再次形成硫酯键。最后，在SUMO E3连接酶的帮助下，SUMO蛋白与底物上特定的赖氨酸残基形成异肽键。除了SUMO化酶，去SUMO化酶也是调控蛋白SUMO化水平的关键因素，包括SENP家族蛋白。蛋白 SUMO 修饰在细胞周期调控、细胞代谢、基因转录、DNA损伤和修复等众多细胞生物学过程中，对底物蛋白质的表达、定位和活性进行调控。与泛素化修饰相比，SUMO化修饰不会介导靶向蛋白质进行蛋白水解，而是参与其他调节其他生物学过程，如蛋白稳定性、核-胞浆转运、亚细胞定位、转录调控、细胞周期等。

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3. 磷酸化
磷酸化由蛋白激酶催化，将ATP γ位磷酸基团转移到底物蛋白质氨基酸侧链，形成蛋白质磷酸化，将疏水非极性蛋白质转化为亲水性极性蛋白质。磷酸化靶位点主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上。磷酸化是一种可逆调节机制，逆向过程是由蛋白质磷酸酶去除相应的磷酸基团。磷酸化修饰在细胞信号转导、调控细胞增殖、发育、分化、凋亡过程中起重要作用。

研究蛋白质磷酸化的方法包括激酶活性测定、磷酸酶处理、32P-ATP同位素放射性标记自显影检测、抗磷酸化蛋白抗体开发、抗体芯片、ELISA、流式细胞术、质谱分析酶解磷酸化蛋白和磷酸蛋白质组学。

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4. 糖基化
糖基化是由糖基转移酶催化将蛋白质附加上糖链，并与蛋白质上的氨基酸残基共价结合形成糖苷键的过程，主要发生在内质网和高尔基体。大多数糖基化存在于细胞表面和分泌蛋白上，具有复杂多样的结构，而存在于细胞核和细胞质中的糖基化类型具有简单的结构并且高度动态。糖基化促进了生物体蛋白质组在基因组编码之外的扩展，广泛参与了细胞黏附、识别、信号转导等重要过程，影响蛋白质的分泌、运输和稳态调控。糖基化有三种常见糖型：(1) N-糖基化，发生在肽链的天冬酰胺残基上；(2) O-糖基化，发生在肽链的丝氨酸/苏氨酸上；(3) C-糖基化，发生在内质网中，在蛋白质折叠、分选和分泌中起重要作用。糖基化对于调节细胞过程至关重要，包括蛋白质折叠、降解、分泌、分子运输和清除、细胞粘附、细胞间相互作用、信号转导、受体激活和内吞作用。

研究蛋白质糖基化的方法包括糖基因芯片；使用放射化学、色谱法、分光光度法和生物正交化学报告仪检测糖基转移酶和糖苷酶活性；通过凝集素结合测定、高效液相色谱法、质谱法进行聚糖分析和糖肽富集。

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5. 甲基化
甲基化通常发生在细胞核和核蛋白，赖氨酸和精氨酸是甲基化中的两个主要靶基残基。赖氨酸侧链上ϵ-氨基上有三个氢可以被甲基替换，因此赖氨酸甲基化具有三种不同的甲基化形式，包括单甲基化 (Kme1)，双甲基化 (Kme2) 和三甲基化 (Kme3)，与异染色质形成，X染色体失活和转录沉默或激活有关。精氨酸只有两个氨基基因可以被甲基修饰，因此精氨酸甲基化具有单甲基精氨酸 (MMA)、不对称二甲基精氨酸 (ADMA) 和对称二甲基精氨酸 (SDMA) 三种类型。甲基化最重要的生物学作用之一是组蛋白修饰，作为经典的表观遗传修饰，核小体中组蛋白的甲基化是染色质结构和基因转录活性的重要调节剂。

蛋白质甲基化可以通过修饰的组蛋白抗体、染色质免疫沉淀 (ChIP)、质谱图谱、生物芯片、同位素PCR以及识别甲基化底物的新蛋白质组学等策略进行研究。

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6. 乙酰化
乙酰化是乙酰基供体以酶或非酶方式共价结合蛋白质N末端和赖氨酸侧链的过程，通过赖氨酸乙酰转移酶 (KAT) 催化。KAT使用乙酰辅酶A作为辅助因子，将乙酰基添加到赖氨酸侧链的ε-氨基基团中，而脱乙酰酶（HDAC）去除赖氨酸侧链上的乙酰基。乙酰化有三种形式：Nα-乙酰化、Nε-乙酰化和O-乙酰化。Nα-乙酰化是一种不可逆的修饰，其他两种类型的乙酰化是可逆的。Nε-乙酰化的过程是动态的和可逆的，是蛋白质构象和活性变化的调节开关。乙酰化在染色质稳定性、蛋白质-蛋白质相互作用、细胞周期控制、细胞代谢、核转运和肌动蛋白成核等生物过程中起着至关重要的作用。

乙酰赖氨酸的研究方法有乙酰化检测试剂盒检测、放射性试剂标记法、Edman测序法、基于质谱的方法以及特定乙酰赖氨酸抗体的免疫荧光分析。

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7. 乳酸化
2019年赵英明教授团队的研究表明，代谢过程中积累的乳酸可以作为前体物质导致组蛋白赖氨酸发生乳酸化修饰，进而调控基因的表达。乳酸化是指在细胞代谢过程中，乳酸的积累修饰组蛋白上的赖氨酸残基。乳酸化修饰是乳酸发挥功能的重要方式，参与表观遗传调节、内在炎症调节、免疫逃逸、肿瘤细胞运动和迁移、血管生成、放射抗性或化学抗性、酸性或缺氧肿瘤微环境以及细胞外基质重塑。

常用于检测乳酸化的手段有HPLC-MS/MS液质联用、Anti-Kla免疫印迹。

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References：

[1] Wu X, et al. Targeting protein modifications in metabolic diseases: molecular mechanisms and targeted therapies. Signal Transduct Target Ther. 2023 May 27;8(1):220.
[2] Dunphy K, et al. Current Methods of Post-Translational Modification Analysis and Their Applications in Blood Cancers. Cancers (Basel). 2021 Apr 16;13(8):1930.
[3] Zhong Q, et al. Protein posttranslational modifications in health and diseases: Functions, regulatory mechanisms, and therapeutic implications. MedComm (2020). 2023 May 2;4(3):e261.
[4] Luo P, et al. The role of SUMOylation in the neurovascular dysfunction after acquired brain injury. Front Pharmacol. 2023 Mar 22;14:1125662.
[5] Reily C, et al. Glycosylation in health and disease. Nat Rev Nephrol. 2019 Jun;15(6):346-366.
[6] Izzo LT, et al. Histone lactylation links metabolism and gene regulation. Nature. 2019 Oct;574(7779):492-493.